CRISPR基因编辑
基因编辑技术是近年来发展并流行起来的能对基因组DNA完成精确“修饰”的一种技术，可实现特定DNA片段的点突变、基因敲入和敲除等，在科研和医疗领域均具有广泛而深远的应用价值。CRISPR 基因编辑技术因其便捷、高效的特点，应用广泛，正不断改变我们治疗疾病的思路和方式。
这里我们在肿瘤细胞系 PC3中利用 CRISPR 基因编辑技术将GFP 和嘌呤霉素耐药基因敲入 ICAM-1 基因（可在细胞粘附和细胞信号传导中发挥作用的基因）以破坏其功能，据此展示 Bio-Rad 产品在支持和加速 CRISPR 基因编辑流程方面的完整解决方案。
一、转染
设计好基因编辑策略后，CRISPR 基因编辑实验流程的第一步是确定将 CRISPR-Cas9 系统有效递送至目的细胞中的最佳方法，转移效率和细胞存活率至关重要。Bio-Rad 提供了以下几种转染和结果监测方法：
1. 先进的 Gene Pulser Xcell 电穿孔系统 20 多年来已在超过 700 项行业认可的研究中得以广泛使用；
2. 如果脂质体介导的转移更有效，那么 TransFectin 脂质体转染试剂提供了另一种温和、有效的选择，甚至适用于原始细胞系；
3. ZOE 荧光细胞成像仪可以方便地在实验台上监测转染效率和细胞健康状况；
4. TC20 自动细胞计数仪可用于转染的多个阶段，提高了细胞计数在各实验阶段的准确性。
在我们设计的基因敲除策略中，使用 TransFectin 脂质体转染试剂或 Gene Pulser Xcell 电穿孔系统转染 PC3 细胞。利用 ZOE 检测 GFP 荧光作为转染成功的初始判断依据。
使用 ZOE 荧光细胞成像仪确认转染效率。
二、富集及单细胞分离
细胞转染完成后需要进行富集，通过识别和仅允许成功发生基因编辑的细胞增殖，可加速实验流程，减少在试剂等消耗品上不必要的开销。富集同样也减少了细胞的传代次数，使得健康的细胞可用于下游分析。使用 S3e 细胞分选仪和 ZOE 荧光细胞成像仪，在不需要其他核心设备的情况下，可以轻松实现细胞富集，并可使实验流程缩短多达 30 天。
我们使用 S3e 流式细胞分选仪对 GFP 阳性 PC3 细胞进行分选，富集成功转染的细胞。在富集和接下来的嘌呤霉素筛选之后，使用 S3e 流式细胞分选仪分离出单个 GFP 阳性的嘌呤霉素抗性细胞，用于后续增殖。ZOE 细胞成像仪可在嘌呤霉素处理前后及早确认细胞的成功富集。
新型流程加速 ICAM-1 基因敲除细胞富集，提高实验效率。
三、基因编辑确认
富集完成后，在进行下游分析前需确认靶标细胞中是否发生了正确的基因编辑。可通过在基因组水平直接检测编辑事件或通过细胞学或蛋白质组学方法间接检测来实现。
基于 PCR 的方法为编辑事件提供了精确、灵敏的检测和定量。高保真 PCR、微滴式数字 PCR (ddPCR)、实时定量 PCR 和高分辨率熔解曲线分析 (HRM) 使得对 NHEJ 和 HDR 编辑事件的分析成为可能。CFX 实时定量 PCR 系统是定量 PCR 和 HRM 的通用平台。对于标准 PCR 和测序验证，iProof 高保真 PCR 试剂能将引入的误差最小化。当编辑效率较低时，ddPCR 技术可提供优异的精度以识别突变频率在 0.5% 以下的等位基因。
ZOE 荧光细胞成像仪让您在平时工作的实验台上便可确认新编辑细胞中敲入和敲除基因的蛋白质表达。与其他Western Blot 方法相比，V3 Western Blot 流程能更快速、更准确地检测蛋白表达。通过加入经过验证的PrecisionAb 免疫印迹抗体，可以进一步消除实验中的不确定性。
我们用 ZOE 细胞成像仪和 V3 Western Blot 流程来确认成功的基因编辑。这些交叉方法，加上用ddPCR 或基于 qPCR 的 HRM 等直接检测方法(数据未显示)，让您有充分的信心应用编辑后的细胞进行下游分析。
通过ZOE细胞成像仪获得的免疫细胞化学结果以及ChemiDoc MP获得的Western blot结果确认基因编辑的成功
三、下游分析
确认细胞被正确编辑之后就可以研究其表型了，您甚至可以对细胞施以某种药物来研究用药的潜在靶点。Bio-Rad 的一系列产品可以从基因组、蛋白质组和细胞学水平对新创建的细胞系进行研究。
我们为高通量基因表达分析提供预先设计、已验证，以及可定制的工具，包括 CFX 自动化系统 II，PrimePCR 基因表达 assay 和 panel，以及功能强大的 CFX Maestro 软件等。若需更灵敏的绝对定量，可使用预设或定制的ddPCR 基因组编辑检测 assay 及ddPCR 系统。
ZE5 流式细胞分析仪可在细胞层面研究编辑的效果。无论您是新手还是专家，都能灵活地运用此设备。它可适用于多达 30 个参数的实验，让您更全面地研究所编辑的细胞以及测试它们在不同处理条件下的反应。
使用 V3 Western Blot 实验流程和经过验证的 Bio-Plex Multiplex Immunoassay 进行多重蛋白质组学分析，可以让您对新细胞系的蛋白质组学概况有一个完整的了解。经过验证的 PrecisionAb 免疫印迹抗体和疾病特异性或定制的多重 Bio-Plex assay 确保了灵敏和可靠的结果。
最后，为了进一步鉴定创建的 ICAM-1 基因敲除细胞系，可使用 PrimePCR 基因表达 panel 和 CFX Maestro 软件来评估基因表达的变化。
对经TNF-α处理的对照和编辑细胞进行基因表达分析。
为何选择Bio-Rad？
Bio-Rad 拥有超过 60 年支持生命科学研究和临床诊断的经验。我们在数字 PCR、转染、基因和蛋白表达分析技术方面处于领先地位。我们的创新产品可以作为独立的解决方案使用，也可以整合到工作流程中，并在第一时间提供准确的结果。CRISPR 基因编辑实验流程只是 Bio-Rad 旨在缩短新疗法研发时间的众多流程之一。