单细胞研究

细胞作为生命体最基本的单元结构，是生命活动的基础。从180多年前科学家观察到了细胞开始，生物学的研究从宏观逐步深入到微观。传统的Bulk研究方法，让每个细胞“被平均”，无法了解组织中不同细胞之间的差异，这就让单细胞的研究越来越迫切。技术的发展让研究人员能够越来越深入的了解单细胞的基因组、转录组、表观遗传组以及蛋白组学。

Bio-Rad利用自身丰富的仪器和试剂产品线，也为单细胞研究人员提供了丰富的解决方案。根据应用方向的不同，大致可归为三类：

路线一：单细胞转录组研究

异质性的细胞群体首先通过处理制备成单细胞的悬液，通过流式分选将具有某类相同标记的细胞群体分选出来，比如细胞大小，表面抗原标记等。分选后得到的细胞悬液，再进行下游的单细胞转录组测序的建库流程。在进行单细胞转录组测序建库前，最重要的一步是要对细胞的活性进行评估。标准的 protocol 要求细胞活性在 90% 以上，所以这就对前期流式分选的要求大大提高了。Bio-Rad S3e流式分选仪采用空气激发的原理，比石英杯激发的分选仪活性更高，可以达到99%的细胞分选活性，在保证精确分选的前提下保障细胞的最大活性。

获得高活性的单细胞悬液之后，开始对单细胞进行微滴包被与加标签的操作，这一步在 ddSEQ 上仅需几分钟即可完成。通过先进的微滴化技术将含有寡核苷酸标签的单个磁珠与单个细胞同时包被在一个微滴中，形成一个单细胞的微环境，后续体系中的裂解液将细胞裂解，释放其转录组 RNA，给每个 RNA 分子加上了标签。再进行第一链与第二链 cDNA 的合成。

通过单细胞转录组测序，研究者们可以分析

a）异质性细胞群体中的细胞亚群或发现新的细胞类型；

b）细胞发育的轨迹；

c）细胞转录机制；

d）细胞信号网络等。

路线二：单细胞已知靶标基因的检测

传统的 bulk 研究，将目标研究基因的水平平均到单个细胞上，导致细胞与细胞之间的差异被平均化而无法发现其中的差异。然后单细胞的目标基因研究，无论是基于 DNA 还是 RNA 的检测，由于单细胞所含的基因组或转录组的含量极低，对检测的手段有更高的要求。

针对此类的研究，可以先将需要分析的细胞群体通过伯乐 S3e 流式分选仪将单个细胞分到8联排的单个孔中，不到2分钟的时间即可完成一个96孔板单细胞的分选，细胞裂解之后根据研究需要再进行 DNA 或 RNA 的检测。伯乐 QX200 微滴式数字 PCR（ddPCR）具有超高的检测灵敏度与检测准确性，可以准确的检测单细胞 mRNA 表达水平、单细胞端粒酶活性、单细胞 HIV 病毒库等。更有研究人员直接将单细胞包进微滴中直接裂解后分析，提高单细胞检测的通量。

过QX200平台对单细胞mRNA进行多重检测。流式分选得到单细胞，经裂解后用一步法反转录，将cDNA一分为二，每个等分的cDNA进行五重的数字PCR检测，所以每个单细胞在ddPCR平台上进行了十重检测。

路线三：单细胞蛋白组研究

在蛋白质水平，流式一直是最为常用的单细胞分析手段。流式细胞技术是一种光学研究手段，它可以将细胞按照不同的特性进行分类，比如根据细胞的大小、是否含有颗粒（granularity）、是否表达某些特殊的分子（可以用荧光标记的抗体标记这些分子）等。流式细胞技术之所以叫“流式”细胞技术，就是因为细胞会“流过”一个个激光发射器和检测器，接受这些设备的检验和分析。

数十年来，流式细胞技术一直都是免疫学研究的最主要手段，但它也有自身的劣势和局限性。比如，可见光谱的波长范围就是一种限制，使得我们可以选择的标记物只有十几种而已，这么少的标记物完全不能研究细胞群体，或者复杂的细胞表型。随着激光器和新型染料的研发，伯乐的ZE5流式细胞仪可以同时进行单细胞30个参数的检测。该高参数流式细胞仪是一款功能强大的分析工具，让科学家能够鉴定和分析异质群体中的独特表型。

下图是用ZE5同时检测了23个蛋白后，对细胞群体做的t-SNE分析。